Nk клетки при вич

Nk клетки при вич

^
Во время острой инфекции ВИЧ наблюдается высокий уровень виремии. Затем после короткого промежутка времени (от 2 до 8 нед) количество копий вируса в периферической крови значительно снижается [38]. Как отмечалось выше, снижение содержания вируса является кажущимся, так как вирус продолжает размножаться в органах лимфоидной системы. Клинически это характеризуется периодом, который раньше назывался латентным, во время которого инфекция прогрессирует без развернутых клинических проявлений иммунодефицита. Но снижение иммунной функции происходит на протяжении всего этого периода, количество CD4+ клеток прогрессивно уменьшается с различной скоростью (в среднем 84 клетки в год). Точный механизм ВИЧ-индуцированного иммунодефицита до конца не установлен. В настоящее время известны несколько предполагаемых прямых и непрямых механизмов, благодаря которым ВИЧ поражает CD4+ клетку (табл. 6).

Таблица 6. Потенциальные механизмы, приводящие к истощению CD4+ клеток при ВИЧ-инфекции

^

  • Аккумуляция интегрированной внутриклеточной вирусной ДНК.
  • Синтез токсических продуктов (в том числе и gp120).
  • Образование синцития.
  • Лизис инфицированных CD4+ клеток путем повреждения мембраны размножающимися вирусами.

Б. Нецитопатическое действие:

  • Иммуносупрессив-ное действие ВИЧ.
  • Gp120-индуцированная анергия.
^

А. Дисфункция и гибель в результате парциальной хронической CD4+ Т-клеточной активации.

Б. ВИЧ-специфический иммунный ответ:

  • Лизис инфицированных CD4+ Т-клеток при помощи вирус-специфических иммунологических механизмов.
  • Иммуномодулированный лизис неинфицированных CD4+ Т-клеток, покрытых Gp120:

1.Гуморальный.

2.Клеточный.

В. Аутоиммунные механизмы.

Г. Суперантигенемия.

Д. Апоптоз.

А. Прямое действие. Прямое действие вируса может быть подразделено на цитопатическое и нецитопатическое.

1. ^ Многими исследованиями показана возможность гибели клеток в результате прямой цитотоксичности вируса или его поверхностных протеинов. Достаточное количество этих протеинов синтезируется самой клеткой. Как установлено, значительное количество CD4+ клеток (от 1 до 10%) и клеток лимфоидной ткани (до 25%) фактически инфицированы провирусами ВИЧ [39], что подтверждает теорию, что ВИЧ обладает прямым цитопатическим действием. Другим предполагаемым механизмом прямого цитопатического действия ВИЧ является нарушение проницаемости клеточной мембраны, что делает ее чувствительной к действию цитокинов и других клеточных продуктов [40]. Кроме того, ВИЧ может поражать предшественников CD4+ клеток.

Таким образом, исследованиями in vitro и in vivo показано что репликация вируса в клетке может оказывать цитопатическое действие и быть причиной гибели клетки. In vitro установлено, что ВИЧ вызывает образование синцития или многоядерных клеток, что является причиной проникновения ВИЧ из инфицированной в неинфицированную CD4+ клетку. Образование синцития обычно является первым свидетельством того, что культура инфицирована ВИЧ. Цитопатический эффект характеризуется баллонной дегенерацией клетки, которая, в основном, является результатом изменения проницаемости клеточной мембраны. Вирусные штаммы, выделенные от пациентов, заразившихся недавно, не обладают способностью образовывать синцитий. С прогрессированием инфекции, снижением количества CD4+ клеток штаммы, способные вызвать образование синцития in vitro, выходят в периферическую кровь. Образование синцития является одним из возможных механизмов разрушения CD4+ клеток и коррелирует с прогрессированием заболевания [36,37]. Однако при исследованиях in vivo многоядерные клетки не были обнаружены нигде, кроме мозга [41], и клиническое значение этого факта не ясно.

2. ^ Как установлено, определенные вирусные протеины (продукт гена tat), экспрессирующиеся в CD4+ клетках, понижают способность этих клеток “отвечать” на антигены, тем самым обусловливая иммунодефицит. Важно подчеркнуть, что вирусные поверхностные протеины сами по себе обладают иммуносупрессивным действием на Т-лимфоциты. Когда комплекс gp120 антигена и антитела связывается с рецепторами CD4+ клеток, они становятся нечувствительными к активации через свои Т-клеточные рецепторы (CD3). Эта “нечувствительность” коррелирует клинически с процессом, называемым анергией, при котором у больного не могут возникать реакции гиперчувствительности замедленного типа. Появление анергии в течении ВИЧ-инфекции может служить маркером прогрессирования заболевания.

Существует мнение, что течение ВИЧ-инфекции определяется вирулентностью определенного штамма, послужившего возбудителем в данном случае. Однако патогенез ВИЧ-инфекции в большей степени определяется взаимодействием вируса с организмом хозяина. Нагляднее всего это демонстрируется тем, что различные ретровирусы имеют разные модели на животных. Так, ВИЧ-1, высоко патогенный для людей, не вызывает поражение иммунной системы у шимпанзе, тогда как ВИЧ-2, значительно менее патогенный для людей, может вызывать иммунодефицит у макак и бабуинов. Эти исследования снижают роль вирулентности, подчеркивая, что уникальные взаимоотношения между поверхностными гликопротеинами вирусов и иммунной системой различных животных моделей определяют возникновение иммунодефицита.

Как отмечено выше, ВИЧ-индуцированный иммунодефицит –мультифакториальный, является результатом как прямых, так и непрямых механизмов разрушения клеток и нарушения регуляции.

Б. Непрямое действие. Иммунологический/ вирологический каскад, приводящий к развитию иммунодефицита, является гораздо более сложным процессом, чем простое разрушение CD4+ клеток и включает несколько различных биологических процессов.

1. ^ В настоящее время хорошо изучен механизм, когда Т-клеточная активация стимулирует репликацию ВИЧ через взаимодействие внутриклеточных факторов с так называемой областью LTR (рис. 6) [42]. Эта активация служит сигналом для трансактивации механизмов, благодаря которым антигены или митогены связываются с поверхностными Т-клеточными рецепторами. Вслед за этим расщепленные клеточные белки входят в ядро, связываются с участками вирусной ДНК. Именно благодаря этому взаимодействию активируется вирусная LTR с последующим увеличением вирусной репликации [43]. Некоторые цитокины могут стимулировать экспрессию ВИЧ через внутриклеточную трансактивацию факторов, которые воздействуют на вирусную LTR.

2. ^ Объектом исследования были гуморальное и клеточное звено иммунитета являлись при ВИЧ-инфекции.

Гуморальный иммунитет. Первоначально основное антиретровирусное действие антител при ВИЧ-инфекции было отнесено к нейтрализующему. Продемонстрирована различная чувствительность разных штаммов ВИЧ к сывороточной нейтрализации.

Одним из важных звеньев иммунного ответа на внедрение инфекционного агента является действие антител, которые напрямую уничтожают инфицированную клетку без участия клеточного звена через активацию системы комплемента. Этот процесс называют антителзависимой клеточномедитированной цитоттоксичностью (ADCC). Специфические анти-ВИЧ ADCC обнаружены у шимпанзе, инфицированных ВИЧ, но не выявлены у людей. [44]. Наиболее вероятной причиной отсутствия этого эффективного иммунологического механизма у людей считают присутствие протеинов ингибиторов комплемента в вирусной оболочке, которая является производной клеточной мембраны клетки-хозяина. Позже эта концепция была подтверждена данными о быстрой инактивации ВИЧ сывороткой различных животных моделей, включая мышей и кроликов, но человеческая система комплемента является неэффективной у этих животных. Дальнейшие исследования направлены на установление клинического значения этих данных.

^ . При ВИЧ-инфекции, наряду с гуморальным иммунным ответом, присутствует и клеточный. Цитотоксичные Т-киллеры, которые могут распознать антиген, не связанный с клетками макрофагальной системы, «убивают» ВИЧ-инфицированные клетки. Однако функциональное значение Т-киллеров снижается в течении ВИЧ-инфекции [45]. Другим фактом является то, что Т-киллеры – эффекторные клетки в системе ADCC.

ВИЧ-индуцированный иммунодефицит обусловлен не только процессом снижением абсолютного числа CD4+ клеток, но и снижения функциональных возможностей клеток иммунной системы. CD4+ клетки больных ВИЧ-инфекцией обладают меньшей способностью синтезировать интерферон и интерлейкин-2 (цитокины, способствующие активации CD8+ клеток и макрофагов) [46,47].

3. ^ . Одним из последствий иммунных нарушений, возникающих при ВИЧ-инфекции, является поликлональная пролиферация В-клеток – результат продукции антител. Антитела к некоторым частям вируса, например, поверхностным гликопротеидам перекрестно реагируют с некоторыми клетками макрофагальной системы. Эти взаимодействия могут быть помехой нормальной активации CD4+ клеток и через активацию системы ADCC привести к гибели клеток хозяина. Другой пример перекрестной реакции антивирусных антител может быть продемонстрирован некоторыми клиническими проявлениями ВИЧ-инфекции – например, ВИЧ-индуцированная тромбоцитопения и т. д. Однако роль аутоиммунных механизмов в патогенезе ВИЧ-инфекции еще не изучена.

4. Суперантигены. Суперантигены – это вирусные или микробные антигены, способные связывать большое количество Т-клеток при помощи специфических Т-клеточных рецепторов. Суперантигены, вызывая массовую стимуляцию Т-клеточного иммунного ответа, являются причиной возникающей в последствии анергии. Как отмечено, в качестве суперантигенов, вовлекаемых в иммунопатогенез ВИЧ-инфекции, выступают различные вирусы, включая вирус Эбштейна-Барра, цитомегаловирусы и другие, а также микоплазмы.

5. Апоптоз. Вообще апоптоз – это запрограммированный механизм «смерти» клетки, впервые описанный в эмбриологии. Он наблюдается в острой фазе ВИЧ-инфекции. Более того, как установлено, механизм апоптоза затрагивает и неинфицированные вирусом лимфоциты [48,49,50]. Эти данные, а также результаты экспериментов на животных моделях свидетельствуют о том, что абнормальная Т-клеточная активация путем взаимодействия поверхностных гликопротеинов с CD4+ клетками, но без активации CD3 клеток, “программирует” смерть CD4+ клеток. Таким образом, апоптоз приводит к гибели клеток и последующему иммунодефициту без непосредственного инфицирования ВИЧ.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что ведущим звеном патогенеза иммунодефицита при ВИЧ-инфекции является поражение Т-хелперов, которые служат ключевым звеном в цепи и гуморального, и клеточного иммунного ответа. В патогенезе иммунодефицита можно схематично выделить две стадии:

  • постепенное снижение количества CD4+ клеток – соответствует клинически латентной стадии заболевания;
  • катастрофическое снижение количества CD4+ клеток – соответствует клинически выраженной стадии болезни.

Как отмечено выше, измененная молекула цитокина запускает даже в неинфицированных CD4+ клетках механизм апоптоза. Таким образом, снижение количества Т-хелперов происходит прямым и непрямым путем, как за счет инфицированных, так и неинфицированных CD4+ клеток. Переход к быстрому прогрессированию заболевания в настоящее время связывают с падением цитолитической активности CD8+ клеток.

Неконтролируемое размножение ВИЧ в различных органах, которое сочетается с интенсивным мутационным процессом (до 10 мутаций в каждом цикле репликации), приводит в конечном итоге к формированию гетерогенных штаммов вируса (медленно и быстро реплицирующихся, образующих и необразующих синцитий , цитопатогенных и нецитопатогенных и т.д.). Образование и превалирование агрессивных штаммов вируса вызывают быструю гибель CD4+ клеток, нарушение функции клеточного звена иммунитета, приводящее к нарушению бактерицидной киллерной и противоопухолевой активности и в конечном итоге – к развитию оппортунистических инфекций, аутоиммунных расстройств, злокачественных новообразований и поражению нервной системы.

^

Под термином «специфические» методы исследования подразумеваются методы, применяемые для диагностики ВИЧ-инфекции, а также характеризующие динамику течения заболевания.

В настоящее время существуют 3 принципиальных пути выявления ВИЧ-инфекции:

  • выделение вируса при его внутриклеточном культивировании;
  • обнаружение в крови вирусных антигенов или провирусной ДНК;
  • определение специфических антител к вирусу.

В 1984 г. группа американских ученых во главе с Р.Галло вывели линию клеток Н9, зараженных ВИЧ, которая впоследствии была использована биотехническими компаниями в качестве источника вирусных белков. И уже в 1985 г. появились первые коммерческие наборы для серологической диагностики ВИЧ-инфекции, основанные на применении метода иммуноферментного анализа ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay).

Условно устанавливается В настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА) является первым, скринирующим этапом обследования. Принцип метода заключается в определении в сыворотке крови суммарных антител к ВИЧ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. При наличии в испытуемых образцах сыворотки крови анти-ВИЧ антител окраска реактива тем более интенсивней, чем выше титр антител.минимальная пороговая окраска, принимаемая за положительный результат. Обычно «порог» определяется на низком уровне, что делает тест более чувствительным, однако увеличивает число ложноположительных результатов. Появление ложноположительных результатов связано с тем, что целый ряд сывороточных белков обладает способностью интерферировать со специфическими антителами к ВИЧ. Если в ELISA получен положительный результат, проводят два повторных исследования данного образца тем же методом; при двух отрицательных результатах повторных исследований кровь считается неинфицированной. Если же одно или оба исследования повторяют ранее полученный положительный результат, его перепроверяют на втором этапе – стадии экспертной диагностики.

На этом этапе осуществляется исследование сыворотки крови с помощью метода иммуноблотинга, позволяющего установить наличие антител к индивидуальным протеинам ВИЧ.

Принцип метода иммуноблотинга заключается в следующем. Разделенные с помощью электрофореза протеины ВИЧ наносят на полоски нитроцеллюлозы, обладающей высокой сорбционной способностью. Обработанные таким образом полоски погружают в раствор, содержащий исследуемую сыворотку крови. При наличии в анализируемой сыворотке антител к протеинам ВИЧ антитела связываются с соответствующими антигенами ВИЧ в тех зонах полоски, где иммобилизованы соответствующие вирусные протеины. После промывания в целях удаления балластных и непрореагировавших сывороточных протеинов, полоски инкубируют в растворе конъюгата, состоящего из антииммуноглобулиновых антител, ковалентно связанных с пероксидазой. Конъюгат, взаимодействуя с Fc-фрагментами антител к белкам ВИЧ, иммобилизуется таким образом в соответствующих зонах нитроцеллюлозной полоски. Затем полоски отмывают от избытка конъюгата и инкубируют в растворе субстрата пероксидазы.

Образование окрашенного продукта пероксидазной реакции происходит в участках связывания конъюгата, то есть в местах взаимодействия антигенов ВИЧ и сывороточных антител к ним. По локализации зон окрашенных участков на полоске судят о том, к каким именно белкам имеются антитела в исследуемой сыворотке.

Выявление в сыворотке антител к поверхностным протеинам ВИЧ (gp160, gp120, gp41), как правило, обнаруживающихся в сочетании с антителами к ядерному белку р24, свидетельствует о наличии ВИЧ-инфекции. Определение антител только к р24 расценивается как сомнительный результат, и такой пациент нуждается в дальнейшем динамическом наблюдении с периодическим выполнением иммуноблотинга или проведении полимеразной цепной реакции и исследования при помощи ДНК-зондов.

Теоретически решающим для уточнения вопроса об инфицированности организма ВИЧ является выделение вируса. Однако на практике это связано с рядом сложных проблем. Среди них можно выделить широкую вариабельность уровня виремии у больных, а также дороговизну культивирования и накопления ВИЧ в больших количествах в связи с высокой стоимостью культуральных сред и телячьей фетальной сыворотки, необходимых для выращивания вируса и т.д.

Другим направлением экспертной диагностики ВИЧ-инфекции являются исследования, направленные на выявление антигенов ВИЧ. Идентификация вирусных антигенов осуществляется в культурах лимфоцитов с помощью методов молекулярной гибридизации (выявление нуклеиновых кислот ВИЧ), обнаружения активности обратной транскриптазы как маркерного фермента ретровирусов и т.д.

Однако самой высокой специфичностью, даже по сравнению с иммуноблотингом, обладает метод ДНК зондов, или молекулярной гибридизации, или полимеразная цепная реакция (ПЦР), который позволяет определять не антитела к белкам ВИЧ, а генетический материал вируса. Это особенно важно в случае вертикальной трансмиссии, когда антитела в крови и инфицированного, и неинфицированного ребенка до 18 мес присутствуют обязательно. Принцип данного метода заключается в следующем. Из лизата лимфоцитов, инфицированных ВИЧ, получают фракцию, содержащую РНК (в том числе РНК вируса). Затем при помощи термостабильной ДНК-полимеразы «нарабатывают» многочисленные молекулы ДНК-копии, что позволяет существенно повысить чувствительность метода. Полученную одноцепочечную ДНК сорбируют на специальных фильтрах, после чего добавляют ДНК-зонды (комплементарные определенным участкам молекулы ДНК, которая получена на матрице РНК ВИЧ). В случае, если исследуемый пул нуклеиновых кислот не содержит генетического материала ВИЧ, меченые зонды не задерживаются на фильтре. По тому, какая часть метки остается на фильтре в результате гибридизации, делают вывод о присутствии в исследуемых лимфоцитах ВИЧ.

Разработка новых молекулярных методов, использование которых дает возможность определять РНК копии ВИЧ, позволила расширить представления про динамику его репродукции на разных стадиях заболевания. Методы, позволяющие определять РНК вируса, изменили представление о латентной стадии ВИЧ-инфекции и свидетельствуют об очень высоком уровне вирусной репликации в организме от момента инфицирования до смерти. В плазме ВИЧ-инфицированного в течение 1 сут продуцируется до 10 000 000 новых вирионов ВИЧ с промежутком синтеза каждой новой генерации до 6 ч. В CD4+ клетках, в которых, в основном, осуществляется репликация вирусов in vivo, образуется наибольшее количество вирионов. Жизненный цикл вируса от начала репликации в клетке до продукции нового потомства, которое инфицирует следующие клетки, составляет 2,6 сут. И именно такой экстраординарно высокий уровень репликации и клеточной деструкции приводят к тем драматическим событиям, которые происходят в организме ВИЧ-инфицированных.

Ранее инфекционный титр ВИЧ выявлялся путем культивирования периферической крови. Увеличение титра вируса в плазме ВИЧ-инфицированных свидетельствовало про прогрессирование заболевания. У пациентов, которые принимали активные антиретровирусные препараты, этот показатель значительно снижался. Так, среди больных с количеством CD4+ большим, чем 200 клеток/мкл, только у 50% определяли ВИЧ в плазме путем культивирования лимфоцитов. Процент выявления вируса в плазме увеличивался в зависимости от стадии заболевания, и на стадии СПИДа составлял приблизительно 75-85%. Определение вирусной РНК молекулярными методами (при помощи ДНК-зондов) осуществлялось практически у всех ВИЧ-инфицированных независимо от клинической стадии заболевания. При этом отмечено, что уровень РНК в плазме имеет широкую вариабельность и в значительной мере коррелирует с клинической стадией. Определение уровня РНК – “вирусной нагрузки” – является очень важным пргностическим маркером течения заболевания.

Использование метода определения вирусной нагрузки позволило установить взаимосвязь между уровнем ВИЧ в плазме и клинической стадией заболевания. Очень важным является факт, что практически у всех ВИЧ-инфицированных, которые не получали антиретровирусную терапию, определяется высокий уровень вирусной РНК в плазме независимо от клинической стадии заболевания.

Общепризнаным в настоящее время показателем риска развития осложнений ВИЧ-инфекции является метод подсчета количества CD4+ клеток. Установлено, что риск развития СПИДа и смерти в ближайшие 24 мес у больных с количеством CD4+ клеток больше 500/мкл составляет 5%, а у лиц с количеством меньше, чем 50 клеток/мкл – 70% . Несмотря на то, что уровень CD4+ клеток является основным маркером стадии заболевания, выявление только одного этого показателя недостаточно для четкого определения прогноза. Более объективным показателем является определение вирусной нагрузки, позволяющим строить более долгосрочные прогнозы течения заболевания.

Другим аспектом использования метода выявления вирусной нагрузки является быстрое получение информации об эффективности антиретровирусной терапии.

Суммируя вышесказанное, необходимо отметить, что определение вирусной нагрузки позволяет контролировать следующие показатели:

  • риск прогрессирования заболевания;
  • необходимость начала антиретровирусной терапии;
  • контроль эффективности антиретровирусной терапии.



Source: medznate.ru


Добавить комментарий